断血流皂苷A的药动学研究

作者:陈娇婷,张道英,王跃生

【摘要】 目的研究断血流皂苷A在大鼠体内的药动学。方法建立柱切换高效液相色谱法测定血浆中断血流皂苷A浓度的方法。色谱条件:预处理柱(P):大连装Krasil 18(20 ×4 ,5 μ);预处理流动相:甲醇-水;预处理流动相流速:1.0 l·in-1;分析柱(A):Lihrspher 100 RP-18e(250 ×4 ,5 μ);分析流动相:甲醇-0.01 l·l-1磷酸盐缓冲液(磷酸调pH =3.0)(60∶40);分析流动相流速:0.6 l·in-1;分析柱柱温:45℃;检测波长:250 n。健康大鼠禁食24 h后,尾静脉注射断血流皂苷A溶液,测定不同时间的血药浓度。用3P87药动学程序对血药浓度一时间数据进行拟合。结果大鼠在尾静脉注射断血流皂苷A后,其主要药动学参数为:Vt(0.31±0.05)L·kg-1,L(1.13±0.32)l·in-1,Ke(0.90±0.18)h-1,t1/2(0.76±0.11)h,曲线下面积AU(24.98±4.82)( μg·h) ·l-1。结论断血流皂苷A在大鼠体内呈一室开放模型,进入体内迅速分布,代谢消除也较快。

【关键词】 断血流皂苷A; 柱切换?高效液相色谱法; 药动学

断血流皂苷A(linpdiside A)系从断血流中提取的主要成分, 属于齐墩果烷型三萜皂苷类,含量较高,且化学性质稳定,断血流为20世纪70年代从民间验方筛选,经临床验证后被国家药典录入的少数几个单味药之一,其疗效确切,安全性高,被公认为中医临床首选口服妇科止血药。临床上断血流制剂被广泛用于 治疗 各种出血、单纯性紫癜、原发性血小板减少性紫癜等症[1]。近年来,有关断血流的研究主要集中于有效成分的提取、鉴别、药理、药效及临床应用。而断血流药动学研究未见报道。为此,本文参照相关 文献 [2~8],建立了柱切换高效液相色谱法测定血浆中断血流皂苷A浓度的方法,对大鼠静注断血流皂苷A后的药动学进行了研究,为其新剂型的研究和临床合理用药提供依据。

1 仪器、试药与动物

Agilent公司1100系列高效液相色谱仪(包括DAD检测器);FV-2A高压切换阀;高速离心机(上海安宁 科学 仪器司);BSZ-2型自动双重水蒸馏系统(上海博通);SartriusBP221S型 电子 天平(美国Sartrius公司);TG328B型析天平(万分之一天平)(上海天平仪器厂)。

断血流皂苷A对照品( 中国 药品生物制品检定所),甲醇为色谱纯,水为三重蒸馏水(自制),其余试剂为分析纯。

健康SD雄性大鼠(江西中医学院动物中心),雄性,体质量(199.7±4.3) g,实验前大鼠禁食12 h,可自由饮水。

2 方法

2.1 色谱条件预处理柱(简称P):大连装Krasil 18(20 ×4 ,5 μ);预处理流动相(简称PP):甲醇-水;预处理流动相流速:1.0 l·in-1;分析柱(简称A):Lihrspher 100 RP-18e(250 ×4 ,5 μ);分析流动相(简称AP):甲醇-0.01 l·l-1磷酸盐缓冲液(磷酸调pH =3.0)(60∶40);分析流动相流速:0.6 l·in-1;分析柱柱温:45℃;检测波长:250 n。

2.2 对照品溶液的配制精密称取干燥至恒重的断血流皂苷A对照品7.5 g,置25 l量瓶中,用分析流动相溶解,并稀释至刻度,摇匀,即得含断血流皂苷A为0.3 g·l-1的对照品溶液。

2.3 样品处理步骤取大鼠血浆样品1.0 l,置2 l具塞离心试管中,加0.3 l·L-1的三氯乙酸0.2 l,离心(4 000 r·in-1,10 in),精密量取上清液置于试管中,氮气吹干,残渣用15%甲醇溶液转入1 l量瓶中,加15%甲醇至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液。

2.4 柱切换系统及操作本实验应用自装定时装置,控制切换阀自动切换。该装置可预置T1(样品预处理时间)和T2(A与P串联时间)。样品进样的同时启动该装置,首先使切换阀处于P与A并联的A(预处理)状态,经T1(2 in)时间的预处理后切换阀自动切换至P与A串联的B状态,使保留在P上的样品组分被AP洗脱至A上,经T2(2 in)时间后,即自动切回初始A状态;待下次进样时再次启动该装置重复操作。#p#分页标题#e#

2.5 专属性实验取空白大鼠血浆按样品处理步骤方法操作,其色谱图见图1(A);空白大鼠血浆加断血流皂苷A对照品的色谱图见图1(B);大鼠静脉注射给药断血流皂苷A后的血浆色谱图见图1()。由图1可知,在本色谱条件下,断血流皂苷A能够检测到,并且与血浆中的内源性物质分离良好。断血流皂苷A的保留时间约为7 in。

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2.6 标准曲线 取空白大鼠血清1 l,加入上述对照品溶液0.5,0.7,0.9,1.1,1.3,1.5 l,置于10 l棕色量瓶中,加甲醇至刻度,得到浓度为0.015,0.021,0.027,0.033,0.039,0.045 g·l-1的系列对照品溶液。按照“2.3”项下样品处理步骤制备成对照品溶液,在拟定色谱条件下精密吸取10 μl注入液相色谱仪,记录峰面积。以进样量(X,μg)对峰面积进行线性回归,得方程为:Y=0.311 3X-0.044 1(r=0.999 5)结果表明断血流皂苷A在15~45 μg·l-1范围内具有良好的线性关系。

2.7 日内和日间精密度 取一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照品大鼠血浆液,按“2.3”项下样品处理步骤处理,采用断血流皂苷A血浆柱切换高效液相色谱法测定,在1天内连续测定6次,得日内精密度分别为1.22%,0.81%和0.39%(n=6);连续3 d测定,测得各浓度的日间精密度RSD分别为:1.67%、0.74%和0.45%(n=6)。

2.8 重复性实验取断血流皂苷A对照品大鼠血浆液,按“2.3”项下样品处理步骤处理制备6份对照品溶液,采用断血流皂苷A血浆柱切换高效液相色谱法测定,得RSD为2.1%(n=6),表明本方法重复性良好。

2.9 样品稳定性实验取一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照品大鼠血浆样品,分别进行样品处理液稳定性实验:进样条件下样品处理液在5℃放置0,4,10,20,40 h进样分析;样品冷冻放置稳定性试验:-20℃冷冻储藏,分别放置0,6,20,40 d后按“2.3”项下样品处理步骤处理进样分析;室温放置稳定性试验:室温放置0,1,2,4 h后按“2.3”项下样品处理步骤处理进样分析。所用测定结果准确度均在89%~112%范围内,RSD均<5%,断血流皂苷A在上述条件下均稳定性良好。

2.10 净化回收率取一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照品血浆液,按前述色谱条件测定含量5次,另取相同进样量断血流皂苷A对照品溶液,直接进样测定。按峰面积 计算 ,得血浆净化回收率。结果见表1。表1 净化回收率(略)

2.11 方法回收率于空白大鼠血浆中加入一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照溶液,按“2.3”项下样品处理步骤处理,按前述色谱条件测定含量5次,求出回收量浓度(即实测值)与加入量浓度之比,即为断血流皂苷A血浆空白加样回收率。结果见表2。表2 方法回收率(略)

2.12 药动学研究方法随机取大鼠6只。按10 g·kg-1尾静脉注射断血流皂苷A,给药后5,10,20,50,90,150,240 in时分别从眼眶取血,肝素抗凝,按“2.3”步骤分离血浆,并于-20℃保存。

采用柱切换高效液相色谱法测定断血流皂苷A的血药浓度,大鼠iv给药后的平均药物浓度一时间曲线见图2。将不同时间断血流皂苷A的血药浓度用3P87软件处理,表明大鼠在尾静脉注射断血流皂苷A后,其血药浓度随时间变化符合一室开放模型,主要药动学参数为:Vt(0.31±0.05)L·kg-1,L(1.13±0.32) l·in-1,Ke(0.90±0.18)h-1,t1/2(0.76±0.11)h,曲线下面积AU(24.98±4.82)( μg·h) ·l-1。

3 讨论

本实验首次建立了生物样品中断血流皂苷A的HPL测定法,断血流皂苷A与血及各组织中的其他成分完全分离,测定结果不易被干扰,方法回收率较高,精密度良好。本法操作简便、成本低廉,适用于断血流皂苷A的药动学研究。

断血流皂苷A在大鼠体内呈一室开放模型,进入体内迅速分布,代谢消除也比较快,其生物半衰期为46 in。#p#分页标题#e#

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