益气活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因表达的影响

作者:黎志萍,赵伟康,徐品初,陈方敏,金国琴,姚明忠

【关键词】 肝细胞

[摘要]目的:观察益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因表达的 影响 。 方法 :以 自然 衰老大鼠为衰老模型,采用RTPR、estern bltting法 研究 益气、活血方药对老年大鼠肝脏p16、p21、增殖细胞核抗原(prliferating ell nulear antigen, PNA)、ylin D1和ylin E RNA转录和蛋白表达的影响。结果:老年大鼠肝脏p16、p21、ylin D1 RNA转录和蛋白的表达增加;PNA、ylin E RNA转录和蛋白的表达降低。与老年大鼠比较,益气、活血方药可下调老年大鼠肝脏ylin D1 RNA转录和蛋白表达,上调促进增殖基因ylin E RNA转录和蛋白表达,但对p16、p21和PNA的调节作用不明显。结论:益气、活血方药主要通过调控ylin D1和ylin E RNA转录和蛋白表达而促进细胞增殖。

[关键词]衰老大鼠; 肝细胞; p16; p21; 增殖细胞核抗原; ylin D1; ylin E; 益气方; 活血方

Effets f reipes fr replenishing qi and ativating bld n senesene related gene expressins in the liver f aging rats

ABSTRAT bjetive: T bserve the effets f reipes fr replenishing qi and ativating bld n p16, p21, prliferating ell nulear antigen (PNA), ylin D1 and ylin E gene expressins in the liver f aging rats. ethds: A reipe fr replenishing qi and a reipe fr ativating bld ere adinistered t aging rats respetively, and the effets f the abve reipes n the expressins f senesene related genes (p16, p21, PNA, ylin D1 and ylin E) ere exained by RTPR and estern bltting ethds. Results: The expressins f p16, p21 and ylin D1 RNAs and prtEins in the liver f the untreated aging rats ere upregulated, hile the expressins f PNA and ylin E RNAs and prteins dereased. As pared ith the untreated aging rats, bth reipes uld dnregulate the expressins f ylin D1 RNA and prtein and upregulate the expressins f ylin E RNA and prtein, but had n bvius effets n the expressins f RNAs and prteins f p16, p21 and PNA. nlusin: Reipes fr replenishing qi and ativating bld an iprve the liver ell prliferatin f aging rats via dnregulating the expressins f ylin D1 RNA and prtein and upregulating the expressins f ylin E RNA and prtein.

KEY RDS aging rats; hepatytes; p16; p21; prliferating ell nulear antigen; ylin D1; ylin E; qibenefiting reipe; bldativating reipe

随着细胞及分子生物学的 发展 ,已经发现一些与细胞衰老密切相关的基因及转录因子(反式作用因子)[1~3]。纵观历代中医 文献 ,延缓衰老的方药基本属于补肾、健脾、益气和活血范畴。近代研究显示:上述四类方药均有不同程度抗自由基、调节免疫功能、提高肝脏蛋白质含量、改善肝脏超微结构等延缓衰老的作用[4]。实验研究还表明:补肾方药能促进老年大鼠肝脏Hras、y、fs、jun RNA的表达,下调p53 RNA的表达[5]。本实验从细胞增殖调控角度,根据中医 理论 ,从益气活血的抗衰经典方中分别选择几味有代表性的中药组成小复方,以自然衰老大鼠为衰老模型, 应用 RTPR和estern bltting法研究益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因p16、p21、ylin D1、增殖细胞核抗原(prliferating ell nulear antigen, PNA)和ylin E表达的影响。

1材料与方法

1.1实验中药 益气方选用党参、黄芪、炙甘草(取自《时氏医道》保元汤),活血方选用川芎、当归、赤芍(取自经方四物汤)。中药制剂采用水提醇沉法制备后,分装于消毒好的塑料瓶中,于-20 ℃保存。#p#分页标题#e#

1.2实验动物 SD雄性大鼠(上海中医药大学实验动物中心提供)24只,分成青年对照组(5月龄)、老年对照组(22月龄)、老年益气组(22月龄)和老年活血组(22月龄)。老年益气组和活血组的用药剂量为临床成人剂量的20倍(按每千克体质量的用药量进行换算),采用饮料方式给药,每周服药5 d,停药2 d,自18~22月龄连续给药4个月。

1.3RTPR 肝组织细胞总的RNA按Trizl一步法提取,具体步骤按试剂说明书操作。βatin PR引物[6]:5’AGATGTAGTTGTATAG 3’,5’GGAAGTATTGAATGGTGA 3’,扩增片段为378 bp;p16 PR引物:5’ATGGAGTTTGAGATAG 3’,5’TTAG GTGTTTGGGGGTT 3’,扩增片段为480 bp;p21PR引物:5’ATGTGATTGGTGATGT3’,5’GGGTTTTTTGAGAAGA 3’,扩增片段为495 bp;ylin D1 PR引物:5’ATGGAAAAGTTGTG 3’,5’TGGTGTTATGTGGTGG 3’,扩增片段为888 bp;PNA PR引物:5’ATGTTTGAGGAGTGAT3’,5’AGATTTTTATTTGA 3’,扩增片段为786 bp;ylin E PR引物:5’AAAGAAGAAGGTGGTTGA 3’,5’TATTTGTTT GTA 3’,扩增片段为1 191 bp。PR扩增反应总体积为50 μl。扩增程序为:95 ℃(30 s)→ [变性94 ℃(30 s)→退火55 ℃(30 s)→延伸72 ℃ (30 s)]×30个循环→72 ℃ (7 in)→4 ℃贮存。根据目的片段的长短及引物的T值设置退火温度及延伸时间。PR产物鉴定电泳,紫外灯下观察,图像 分析 系统扫描。

1.4estern Bltting 采用放射免疫沉淀测定法(radiiunpreipitatin assay, RIPA)[7]。取肝脏组织100 g加入单去污细胞裂解液900 μl,冰浴中匀浆。匀浆后立即加入100 μl蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟液(phenylethylsulphnyl fluride, PSF)和40 μl混合蛋白酶抑制plete液(plete EDTAfree prtease inhibitr ktail tablet, 1片加1 l水),4 ℃ 10 000 r/in离心10 in,取上清液于-70 ℃冷冻保存。24 h后10 000 r/in离心10 in,取上清液分装,-70 ℃冷冻保存。Lry (Flinialteau)法[8]测定蛋白含量。各组蛋白各取30 μg,采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdiu ddeylsulfateplyarylaide gel eletrphresis, SDSPAGE)和免疫印迹反应,用Supersignal EL发光剂荧光显色X光胶片曝光,观察蛋白条带。

1.5图像处理及统计分析 RTPR、esternbltting实验结果分别采用Leia Q500I和上海复日Sartvie 2001生物电泳图像分析系统进行图像分析。所有实验数据均采用SPSS 9.0统计软件进行统计处理,统计学方法采用方差分析及q检验。

2结果

2.1益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因RNA表达的影响与青年组比较,老年大鼠肝脏p16、p21、ylin D1基因RNA的表达明显上调(P<0.01),PNA和ylin E RNA的表达明显下调(P<0.01)。与老年组比较,益气、活血方药组ylin D1基因RNA的表达明显下调(P<0.01),而ylin E RNA的表达则明显上调。益气、活血方药对p16、p21和PNA RNA的表达有改善作用,但无统计学意义。见图1、图2、表1。

2.2益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因蛋白表达的影响与青年组比较,老年大鼠肝脏p16、p21、ylin D1基因蛋白表达明显上调(P<0.01),PNA和ylin E蛋白表达明显下调(P<0.01)。与老年组比较,益气、活血方药组ylin D1基因蛋白表达明显下调(P<0.01),而ylin E蛋白表达明显升高(P<0.01)。见表2、图3。

图1 p16和p21琼脂糖凝胶电泳(略)

Fig 1 Agarse gel eletrphresis f p16 and p21

: arker; 1:Yung ntrl grup; 2: Untreated grup; 3: Qibenefiting reipetreated grup; 4: Bldativating reipe treated grup

图2 ylin D1、PNA和ylin E琼脂糖凝胶电泳(略)

Fig 2 Agarse gel eletrphresis f ylin D1, PNA and ylin E#p#分页标题#e#

: arker; 1: Yung ntrl grup; 2: Untreated grup; 3: Qibenefiting reipetreated grup; 4: Bldativating reipetreated grup

表1 益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因RNA表达的 影响 (目的基因/βatin)(略)

Tab 1 Effets f qibenefiting and bldativating reipes n RNA expressins f p16, p21, PNA, ylin D1 and
ylin E genes in the liver f rats (target gene/βatin)

*P<0.05,**P<0.01, vs yung ntrl grup; △△P<0.01, vs untreated grup

表2 益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因蛋白表达的影响(目的基因/βatin)(略)

Tab 2 Effets f qibenefiting and bldativating reipes n prtEin expressins f p16,p21,PNA,ylin D1 and
ylin E genes in the liver f rats (target gene/βatin)

**P<0.01, vs yung ntrl grup; △△P<0.01, vs untreated grup

图3 p16、p21、PNA、ylin D1和ylin E蛋白印迹杂交结果(略)

Fig 3 estern bltting results f p16, p21, PNA, ylin D1 and ylin E genes

1:Yung ntrl grup; 2: Untreated grup; 3: Qibenefiting reipetreated grup; 4: Bldativating reipetreated grup

3讨论

衰老是生物体在其生命的后期阶段所出现的进行性、全身性、内在性,由多因素共同作用的循序渐进的退化过程。近年来从基因水平 研究 衰老过程已成为衰老机制研究中的热点。已经发现:有些细胞增殖调控相关基因,主要是原癌基因、抑癌基因及端粒酶调控相关基因等,在年轻和衰老细胞中的表达明显不同。原癌基因是一组参与细胞增殖和生长调控的基因。细胞衰老时,多数原癌基因的表达水平降低,少数升高。由于原癌基因表达产物大多是信号传导途径或细胞周期蛋白相关成员,它们的表达水平降低或活性减弱,会使细胞对刺激的反应性降低,或使细胞周期进程减慢,从而降低细胞增殖水平。抑癌基因的主要功能是对细胞分裂和生长进行适当抑制,防止细胞周期失控导致无限扩增和分裂生长。衰老时,有些抑癌基因的表达或活性增加。具有细胞增殖调控功能的衰老相关基因包括p21、p16、细胞周期素(ylin)D1、周期素依赖性激酶(ylindependent kinases, DK) 2、p53、视网膜母细胞瘤(retinablasta, Rb)基因和PNA等。上述衰老相关基因的调控是相互联系的[9]。

中医认为人体的生长、发育和衰老与“肾”密切相关。“肾精虚衰”是衰老的主要原因。同时又认为“脾胃为血气阴阳之根蒂”,“脾胃既和,其人寿;脾胃不和,其人夭”,因此也重视奉养脾胃精气在延年中的作用。《素问・至真要大论》还提出“气血正平,长有天命”,气血运行失常,则能影响脏腑、经络、阴阳等方面功能的平衡,出现五脏六腑各方面病变,加速衰老过程。因此纵观历代 文献 有关“耐老”、“不老”方药,研究其治法基本属于补肾、健脾、益气、活血范畴。

本实验主要在比较补肾、健脾、益气、活血方药对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞增殖调控作用的基础上,进一步观察益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因p16、p21、ylin D1、PNA和ylin E的RNA转录和蛋白表达的影响,以探讨益气、活血方药对老年大鼠肝脏细胞增殖的作用机制。结果表明:老年大鼠肝脏p16、p21、ylin D1基因RNA和蛋白表达明显升高;PNA、ylin E RNA和蛋白表达明显降低。提示:老年大鼠肝脏细胞周期蛋白依赖的激酶抑制因子p21、p16表达增高,可能通过抑制ylin D1DK4和ylin EDK2的活性,使Rb蛋白磷酸化水平降低,从而抑制细胞增殖。p21还可能与PNA结合,使DNA合成受阻。由于细胞不能进入增殖周期,最终发生衰老。细胞周期蛋白ylin D1是原癌基因的表达物,与DK4结合后,可促进G1/S期转变。文献报道:衰老时ylin D1蛋白水平升高,但ylin D1DK4复合物活性降低,影响细胞增殖[10]。本实验结果显示:衰老大鼠肝脏ylin D1的升高与文献报道一致。PNA为DNA聚合酶δ的附属蛋白,参与DNA复制;ylin E与DK2结合,参与G1/S期的转变。本实验结果显示:与青年鼠比较,老年大鼠PNA和ylin E的表达明显下调,则必然影响细胞周期的正常运行,抑制细胞增殖。益气、活血方药能不同程度降低老年大鼠肝脏ylin D1基因RNA和蛋白的表达,上调肝脏ylin E基因RNA和蛋白的表达,但对p16、p21、PNA RNA和蛋白的表达作用不明显。结合本实验室前期实验流式细胞仪检测细胞周期的结果(益气、活血方药可降低老年大鼠肝组织细胞G0/G1期比例,增加G2/G1期细胞比值),提示益气、活血方药可促进老年大鼠肝组织细胞的增殖[11]。益气、活血方药还能不同程度提高2BS衰老细胞的代谢活力和降低衰老相关半乳糖苷酶的活力[12,13],推测益气、活血方药促进老年大鼠肝组织细胞增殖的作用可能部分与下调ylin D1、上调ylin E RNA和蛋白的表达有关。#p#分页标题#e#

[ 参考 文献]

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3Sith JR, PereiraSith . Repliative senesene: ipliatins fr in viv aging and tur suppressin[J]. Siene, 1996, 273(5271): 6367.

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5姚明忠, 顾文聪. 固真方对老年大鼠肝脏原癌基因和抗癌基因表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 1997, 17(基础 理论 特辑): 67.

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11俞仲毅, 赵伟康. 益气活血方药对衰老大鼠肝脏细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中西医结合学报, 2004, 2(3): 196198.

12陈方敏, 赵伟康, 徐品初, 等. 补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞增殖的调控作用[J]. 中药药理与临床, 2003, 19(1): 2628.

13陈方敏, 赵伟康, 徐品初, 等. 补肾、益气、健脾、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用[J]. 中国中西医结合杂志, 2003, 23(11): 837840.

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