山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

2.4Ss成骨、成软骨和成脂诱导后免疫组化和病理染色检测

Ss经过成骨诱导21 d后,Ⅰ型胶原组化染色可见细胞浆里充满棕黄色的颗粒,胞核着蓝色;骨钙素染色也可见大量阳性棕黄色颗粒。Ss成软骨诱导21 d后,Ⅱ型胶原染色可见胞浆和细胞外基质着棕黄色。茜素红和vn Kssa染色可见经过成骨诱导21 d后的细胞分泌的细胞外基质着色;油红染色可见成脂诱导21 d的细胞胞浆里的油滴呈桔红色,胞核呈蓝色。

3讨论

骨髓Ss主要来源于骨髓网状间质,在骨髓中含量很低,估计约0.001%~0.01% [1],因此,从骨髓中分离、培养达到一定数量满足实验和临床需求就显得尤为重要。利用密度剃度离心的方法获得骨髓中单个核细胞,进而再利用贴壁特性纯化细胞,提高了Ss的克隆性。本实验证实,利用此种方法获得的山羊的Ss具有良好的克隆形成能力,原代培养5 d即可形成明显的克隆,14 d即可长满单层传代。体外传12代,细胞增殖能力仍较强,形态良好,仍具备多潜能分化能力。

Ss的鉴定目前尚缺乏严格、统一的标准,根据细胞 治疗 国际社会推荐的标准(Internatinal Siety fr ellular Therapy,IST)[8],人的Ss的鉴定标准如下:①细胞表现成纤维细胞样形态,可以贴壁生长;②具有特异的表面分子表达;③具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的多潜能。该标准同时提出标准①和③在各种动物间都符合,但是标准②在各动物间可能存在差异。本研究分离纯化得到的Ss具有贴壁生长的特性,形态类似成纤维细胞;第三代Ss表面分子D29和D44阳性(比例大于95%),而D45和D62L阴性(比例小于2%);通过成骨、成软骨和成脂肪诱导培养基诱导21 d后,通过Ⅰ型胶原和骨钙素免疫组化染色以及茜素红和vn Kssa病理染色证实分化为成骨细胞,通过Ⅱ型胶原免疫组化染色证实分化为软骨细胞,通过油红染色证实分化为脂肪细胞。进一步,我们还通过检测相应的成骨、成软骨和成脂肪基因的表达来证实Ss的分化情况。因此,根据目前比较广泛的可被大多数研究者接受的鉴定标准,我们从山羊骨髓中获取的这些细胞即是Ss,其具有Ss的基本特性。

骨缺损修复一直是医学研究的重点和热点,迄今为止,临床上对于创伤、感染和肿瘤等造成的大范围的骨缺损的修复治疗仍旧缺乏理想的解决方案。伴随着组织工程概念的提出,在骨组织的缺损替代治疗方面,通过Ss结合组织工程支架材料构建的组织工程骨表现出良好的应用前景。已有大量的研究显示[9?11],通过应用Ss和支架材料体外构建的复合物,可以显著增强移植物在节段性骨缺损处形成骨组织,有利于缺损的修复。这些为我们希望通过Ss作为种子细胞构建抗感染的组织工程骨,修复由于感染造成的骨缺损奠定基础,也将成为我们应用Ss修复骨缺损的理论依据。

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