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分子生物学 专论 课件
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专业:生物化学与分子生物学 方向:动物基因功能组与分子免疫学 姓名 : 王 文 文 学 号: 2012103054 囊型包 虫 病( CE)是世界上最为广泛高度 传播的人畜共患病之一,在中国西北地区 传播也非常 盛行。据估计,目前 大约 6百万 人有感染这种疾病的风险,其中超过 1百万 人亟需药物治疗。此外,还有超过 85万驯 养的 动物( 58羊 )已经感染上了 CE, 这 将导致大量的公共健康问题 。因此,控制 CE势在必行。 在过去的几十年里 ,基于 免 疫 控制 CE的研究受到了更多 的 关注。 主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC)MHC是 由一个有组织 的紧密 连锁的基因簇编码的 分子构成,该分子可结合处理包 括原性肽寄生虫在内的肽抗原 并提交给 T淋巴细胞,从而 触发抗原 特异性免 疫 应答 。由于免疫 活动参与各种 疾病的临床过程 , MHC基因表达的信息已 参 与人类 疾病,如类风湿关节炎( Kerlan-坎东等 。 2001年),强直性脊柱 炎(王等人, 2009),过敏性 血管炎(王等人, 2007),以及羊 病如 淋巴 性间质性肺炎(伍德尔等人, 1997) 。虽然 我们此前曾报道 ,哈萨克羊的 MHC基因与 CE抗性 或 敏感性有关( Li等人, 2010), 然而,没有系统的研究 报道 MHC基因在处于不同阶段感染 CE羊的 表达 。本研究旨在 探讨 MHC-DQB1基 因 在感染受细粒棘球 绦虫的 中国美利奴 羊的外 周血淋巴细胞( PBL) mRNA的 表达 的 动态 变化。本研究针对 囊型包 虫 病 的有效控制 方案将 具有 根本意义。 1.材料 14周岁 的中国美利奴羊,预留,与其他品种分开饲养 。要求它们 体内抗 体对包虫囊液( HCF) 抗原均为 阴性。 抗体由商业 绵羊棘球蚴病 ELISA试 剂 盒检测。 2.方法 每只 羊经口感染 10个来自于狗肠细粒棘球蚴带有卵细胞的妊娠节片。于 0 天, 7, 21, 30和 60天分别 感染 后从 羊的颈 静脉 收集 血液 样本中的钠肝素 溶液,实验终止时按照肉类例行检查和电镜观测,对 CE进行诊断,将实 验过程中得到的血液样品分为 A(内部器官有包虫囊肿)和 B(自我治愈) 组以进行下一步实验。 绵羊外周血分离和体外 培养; 总 RNA的提取和逆转 录; 通过 PCR扩增 cDNA; 实时 RT-PCR; 统计分析 聚蔗糖泛影葡胺分层液 密度梯度法 离心 分 离抗凝静脉血 获得 PLB淋巴细胞 洗涤两 次 磷 酸盐缓冲盐水( PBS; pH值 7.4) 台酚蓝溶液 RPMI1640培养基 计数稀释 转移 平底 24孔板 并放在 10%二氧化碳的培养箱中。 标准 的 Trizol提取 程序 ; 用紫外 /可见分光光度计 测定 RNA浓度并保存在 -80度条件下; 加 RNA酶抑制剂反应进行逆转录并进行 PCR扩增 cDNA; 用于 DQB1PCR扩增的 寡核苷酸 引物用 Primer Premier5.0找出, 而 G3PDH作为内部 控制 引物 使用 蒙塔涅等人所描述的。 将 PCR产物克隆 和测序,以检测是否存在 的靶基因。 从上述制备的 DQB1转录水平 采用实时荧光定量 PCR测定 DNA 在基因 转录水平从上面的 准备的 DNA来确定 使用 实时荧光定量 PCR; 寻找和 G3PDH相对应的归一表达水平的内部 控制物。 1.结果 A组 0-21天感染表现逐步增加直到第 30天开始 出现迅速锐化; 在 B组中,在实验过程中, DQB1 mRNA的 表达经历 了从开始的急剧 增加感 染 ( 0天),感染后 7天 , 此后 表现出明显 的减 少感染, 直到第 30天,经历 了从 第 30天到第 60 天 的高度 感染。 相比较而言, DQB1基因在 B组 比 A组之间的天 0和感染后第 21天 表现出较高 的 表达 水平。 特别是,在第 7天感染后 , DQB1 B 组的 mRNA表达 水平显 着高于 A组 。
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